涂平板:为取得最佳的感受态效率,必须先把甘油菌或其它形式保存的菌种涂LB平板,并培养过夜.接种:取一有新鲜培养的菌种的LB平板,后续操作均在超净台内进行.把镊子的顶端在70%酒精中蘸一下,并在酒精灯上略略烧一下,使镊子的顶端处于无菌状态.用镊子夹取一个无菌的塑料枪头或牙签,从平板上挑取一个单克隆,然后把蘸有菌种的塑料枪头或牙签放到装有3毫升LB的细菌培养试管内.上述操作也可以使用接种环等进行操作.
培养:37℃约200rpm培养过夜,通常培养时间控制在16小时左右为宜.绝对不宜超过18小时.再接种培养:根据需要制备的感受态细菌的量,按照1:100的比例用新鲜培养的过夜菌接种培养.例如取500微升的新鲜过夜菌到50毫升的LB中继续37℃约200rpm培养.通常在大约培养2-2.5小时后OD600可以达到0.3-0.5.
制备感受态细菌:在培养的细菌OD600达到0.3-0.5时,4℃2000g离心5分钟收集细菌.如果离心沉淀前的菌量为50毫升,按后续操作进行,如果是其它体积则按比例换算后进行后续操作.用5毫升预冷的LB重新悬浮起细菌沉淀,加入5毫升在冰浴或冰水浴上融解的感受态制备试剂,混匀,冰浴放置5分钟.然后再轻轻混匀,根据实验需要适当分装到1.5毫升或0.5毫升的离心管内后-70℃保存.
注:如果以后会只做单管的转化,可以分装成每管最少50微升或100微升,如果以后一次性做多个转化,可以每管分装500微升或更大体积.-70℃保存后,感受态的效率会随时间的推移逐渐下降,但通常在半年内使用转化效率下降不会太多.总的来说,新鲜制备的感受态要比冻存的感受态转化效率更高一些.
